Dica do autor: O pulo do gato para correlacionar métodos de detecção genética é entender o que cada técnica consegue ver em termos de escala: algumas olham a sequência base a base, outras olham cromossomos inteiros, outras avaliam o produto transcrito (mRNA) e outras quantificam cópias de regiões específicas. Sequenciamento direto do DNA (Sanger ou NGS) é a ferramenta para identificar variações pontuais e pequenas inserções/deleções. A citogenética clássica (cariótipo) detecta alterações numéricas e estruturais em nível cromossômico — pense em trocas grandes, deleções/duplicações macroscópicas e aneuploidias. Southern blot é robusto para detectar grandes rearranjos, deleções/insertions de maior porte, expansões de trincas repetitivas e amplificações, especialmente quando o tamanho da fragmentação de DNA importa. A RT‑PCR avalia o RNA mensageiro convertido em cDNA, sendo útil para estudar expressão gênica, identificar perda de expressão e variantes de splicing. Por fim, técnicas de amplificação com sondas (ex.: MLPA/assays de multiplex com sondas) são feitas justamente para detectar variações do número de cópias (CNV) em múltiplas regiões de forma sensível e multiplexada. Fique ligado: a ordem correta é aquela que casa a escala do problema com a resolução da técnica — ponto = sequenciamento; cromossomo inteiro = citogenética; grandes rearranjos/expansões = Southern; mRNA = RT‑PCR; CNV multiplexada = amplificação com sonda.

Alternativa A: INCORRETA. A sequência proposta (1, 2, 3, 4, 5) colocaria citogenética para detectar mutações ponto e pequenas indels, o que é incompatível: citogenética visualiza alterações em nível cromossômico (anel, translocação, deleção grande), não mutações pontuais. Sequenciamento (2) estaria em posição que não casa com a primeira descrição. Portanto a alternativa erra a correspondência entre resolução técnica e tipo de alteração.

Alternativa B: INCORRETA. A sequência (2, 4, 5, 1, 3) começa bem ao colocar sequenciamento para mutações pontuais, mas depois troca a citogenética por Southern e MLPA/sonda em posições trocadas. Especificamente, a segunda descrição pede anormalidades numéricas ou estruturais de cromossomos — isso é citogenética (1), não Southern (4). A última posição, que descreve variações no número de cópias multiprefixada, foi atribuída a RT‑PCR (3), porém isso é função de técnicas com sondas/MLPA (5). Assim, múltiplas inversões fazem a alternativa incorreta.

Alternativa C: INCORRETA. A alternativa (2, 1, 5, 3, 4) acerta as duas primeiras posições (sequenciamento para pontos e citogenética para cromossomos), mas atribui a terceira descrição (grandes deleções, inserções, rearranjos, expansões de trincas, amplificações) à amplificação com sonda (5) — na prática, grandes rearranjos e expansões de trincas são classicamente investigadas por Southern (4). A amplificação com sondas é mais empregada para detectar CNVs em nível exon/genes (MLPA), não para caracterizar expansões de trincas em detalhe; por isso a ordem está equivocada.

Alternativa D: INCORRETA. A sequência (5, 4, 3, 2, 1) coloca amplificação com sonda para mutações pontuais — isso não bate: sondas e MLPA detectam CNVs, não SNVs de base. Além disso, cita Southern para anormalidades numéricas/estruturais (essa é tarefa da citogenética), e RT‑PCR para grandes deleções/expansões (RT‑PCR avalia RNA, não é a primeira escolha para grandes rearranjos genômicos). Logo, trocas conceituais deixam essa alternativa errada.

Alternativa E: CORRETA. A sequência (2, 1, 4, 3, 5) casa direitinho: 2 — sequenciamento detecta mutações em ponto e pequenas indels; 1 — citogenética identifica anormalidades numéricas e estruturais dos cromossomos; 4 — Southern blot é a técnica clássica para grandes deleções/insertions, rearranjos, expansões de trincas e amplificações; 3 — RT‑PCR analisa o mRNA convertido em cDNA, útil para avaliar expressão e detectar perda de expressão ou variantes de splicing; 5 — amplificação com sonda (MLPA/técnicas semelhantes) detecta variações no número de cópias multiplexadas. No fim das contas, essa alternativa respeita a resolução e a aplicabilidade de cada técnica.

Resposta: Alternativa E