Dica do autor: A construção de um DNA recombinante é um processo central na engenharia genética e segue uma sequência lógica e padronizada de etapas. Primeiro, realiza-se a clivagem enzimática do DNA de interesse e do vetor plasmidial usando enzimas de restrição que cortam em locais específicos, gerando extremidades compatíveis. Em seguida, o fragmento de DNA de interesse é ligado ao vetor com a ajuda da DNA ligase, formando uma molécula recombinante. Essa molécula é então introduzida na célula hospedeira — geralmente Escherichia coli — por métodos como transformação química ou eletroporação. Após isso, as células são cultivadas em meio seletivo (como um antibiótico), permitindo a seleção apenas daquelas que receberam e expressam o plasmídeo recombinante. Essa sequência é essencial para garantir o sucesso da clonagem e expressão gênica.

Alternativa A: CORRETA. Esta é a sequência correta:

1. Clivagem enzimática com enzimas de restrição;
2. Ligação ao vetor com DNA ligase;
3. Inserção em célula hospedeira (transformação);
4. Seleção das células transformadas com base em marcadores, como resistência a antibióticos.

Alternativa B: INCORRETA. A amplificação geralmente ocorre após a clonagem, não como primeira etapa. Além disso, exonucleases removem nucleotídeos das extremidades, o que não é desejado nesse processo. A transdução é um método de transferência de genes mediado por vírus, não é a via mais comum na clonagem com plasmídeos.

Alternativa C: INCORRETA. RNA mensageiro não é usado diretamente na ligação com vetores na clonagem genética. O foco é no DNA, não no RNA. A hibridização e eletroforese são técnicas analíticas, não etapas do processo de construção de DNA recombinante.

Alternativa D: INCORRETA. A transcrição reversa transforma RNA em DNA, aplicável em clonagem de cDNA, mas não é uma etapa necessária para todos os casos de DNA recombinante. Além disso, a tradução e ligação ao plasmídeo não ocorrem nessa ordem, e a sequência proposta está conceitualmente incorreta.

Alternativa E: INCORRETA. A digestão por proteases refere-se à quebra de proteínas, não de DNA. As demais etapas também não fazem parte do protocolo correto de construção de DNA recombinante.

Resposta correta: Alternativa A

Referências:

• NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: princípios de bioquímica. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2021.
• RODWELL, V. W. Bioquímica ilustrada de Harper. 31. ed. Porto Alegre: AMGH, 2021.
• DEVLIN, T. M. Bioquímica: manual do estudante. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2022.