Dica do autor: O sucesso de um experimento de clonagem genética depende de uma série de etapas fundamentais, e uma das mais críticas é a ligação eficiente do gene de interesse ao vetor plasmideal. Após a digestão do plasmídeo e do DNA de interesse com enzimas de restrição específicas, que geram extremidades compatíveis, a enzima DNA ligase é utilizada para unir essas extremidades fosfodiésteras, formando uma molécula de DNA recombinante estável. Essa ligação garante que o fragmento inserido possa ser replicado dentro da célula hospedeira, utilizando a maquinaria de replicação do plasmídeo. Sem essa etapa, o gene não se integra ao vetor e, portanto, não será replicado ou expresso. Esse é um dos pilares da biotecnologia molecular moderna, utilizado em terapias gênicas, produção de proteínas recombinantes e desenvolvimento de vacinas.

Alternativa A: CORRETA. A ligação do gene de interesse ao vetor plasmideal é realizada pela enzima DNA ligase, que forma ligações covalentes entre os fragmentos de DNA, unindo as extremidades compatíveis geradas por enzimas de restrição. Essa é uma etapa absolutamente indispensável para a construção do DNA recombinante funcional.

Alternativa B: INCORRETA. Exonucleases degradam nucleotídeos a partir das extremidades do DNA e não são utilizadas na preparação dos vetores plasmidiais. Ao contrário, elas comprometeriam a integridade do plasmídeo e do gene de interesse, impedindo a clonagem.

Alternativa C: INCORRETA. A transcrição in vitro é um processo usado em aplicações específicas, como produção de RNA para vacinas ou sondas, mas não é necessária para a inserção e replicação do gene no plasmídeo dentro das bactérias. Neste caso, o processo relevante é a replicação plasmidial in vivo.

Alternativa D: INCORRETA. Anticorpos monoclonais são ferramentas para identificação ou purificação de proteínas específicas, mas não participam da etapa de inserção gênica no vetor. Eles podem ser úteis em etapas posteriores para detecção da proteína expressa, mas não para garantir a clonagem correta.

Alternativa E: INCORRETA. A inibição da DNA polimerase bacteriana inviabilizaria a replicação do plasmídeo e da própria célula hospedeira, o que impediria a clonagem. Na verdade, a função da DNA polimerase é essencial para a multiplicação do plasmídeo recombinante dentro da bactéria.

Resposta correta: Alternativa A

Referências:

• NELSON, D. L.; COX, M. M. Lehninger: princípios de bioquímica. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2021.
• RODWELL, V. W. Bioquímica ilustrada de Harper. 31. ed. Porto Alegre: AMGH, 2021.
• DEVLIN, T. M. Bioquímica: manual do estudante. 8. ed. Porto Alegre: Artmed, 2022.