O ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é um teste sorológico imunoenzimático cuja metodologia se baseia em reações antígeno-anticorpo detectáveis através de reações enzimáticas.
Existem vários modelos de ELISA, e eles envolvem testes usando anticorpos como reagentes. Imunoensaios enzimáticos como estes utilizam enzimas ligadas a um dos reagentes.
A presença de antígenos e/ou anticorpos no espécime clínico é revelada pela produção de cor com a adição do substrato da enzima e de uma substância cromógena, indicando uma reação positiva. As enzimas mais comumente utilizadas como marcadores nos ELISA são peroxidase e fosfatase alcalina.
O que são testes sorológicos ELISA?
Os testes sorológicos utilizam o soro como amostra para detectar a presença de anticorpos contra:
- Parasitas
- Fungos
- Bactérias
- Vírus
Através desse método é possível indicar se o indivíduo esteve em algum momento em contato com estes agentes. Além disso, pode-se detectar a presença dos antígenos, indicando diretamente a sua presença no organismo.
Quando esse teste foi desenvolvido?
O teste ELISA foi desenvolvido e descrito por Peter Perlmann e Eva Engvall na Universidade de Estocolmo, Suécia, em 1971. Esses cientistas demonstraram a medida quantitativa de IgG no soro de coelho utilizando a enzima fosfatase alcalina como marcador.
Antes do surgimento do ELISA, as técnicas de imunoensaio usavam marcadores radioativos, o que trazia riscos para a saúde dos pacientes. O ELISA então surge como um método imunoenzimático alternativo, cuja técnica permite a análise de amostras de proteínas imobilizadas em poços de microplacas, usando anticorpos específicos e enzimas como marcadores.
Além disso, é um método muito sensível, de fácil execução e aplicável diretamente sobre as amostras sorológicas coletadas.
Como é realizado o teste ELISA?
Para a realização do teste imunoenzimático a técnica, em sua forma mais simples, é necessário seguir o passo a passo:
- Um reagente é conectado a uma fase sólida, geralmente uma placa de plástico com um formato de vários pequenos poços.
- Adição de reagentes, ou seja, do soro como amostra clínica. É nessa etapa que ocorre o reconhecimento de antígeno-anticorpo, caso haja especificidade. O anticorpo ADICIONADO É LIGADO A UMA ENZIMA.
- Após período de incubação, a separação dos reagentes ligados e livres, que são adicionados subsequentemente à fase sólida, é feita por uma simples etapa de lavagem.
- Uma reação enzimática é utilizada para produzir cor e quantificar a reação, através da adição do substrato específico para a enzima utilizada.
- A leitura dos resultados se faz pela medida da ação enzimática sobre substrato cromogênico, levando a mudança de cor da solução quando há reação antígeno-anticorpo, configurando um resultado positivo.
Qualquer forma ou superfície disponível em uma molécula que possa ser reconhecida por um anticorpo constitui um determinante antigênico ou epítopo. Antígenos polivalentes contêm múltiplos epítopos idênticos aos quais moléculas de anticorpos idênticos podem se ligar.
As funções dos anticorpos são dependentes de sua habilidade em se ligar especificamente a antígenos. Devido a esta ligação específica de antígeno-anticorpo, tem-se a precisão do teste ELISA.
Quais são os tipos de testes ELISA?
Existem 4 tipos principais de testes te ELISA, são eles:
- ELISA direta
- ELISA Indireta
- Sanduíche
- ELISA de bloqueio.
Fonte: Abbas, 2015
ELISA direto
O ELISA direto pode ser considerado como a forma mais simples do ELISA. É utilizado na dosagem de anticorpo, logo, identifica se o indivíduo foi exposto a determinada doença. Nessa reação, o antígeno é fixado a um suporte sólido contendo vários pequenos poços onde a amostra contendo anticorpo é adicionada para reagir. Este anticorpo, ligado a uma enzima, é chamado de anticorpo primário.
Nessa etapa, ocorre o reconhecimento de antígeno-anticorpo e, após procedimentos intermediários (incubação e lavagem), há retirada dos componentes não fixados. Em seguida, a reação positiva é visualizada com a adição do substrato específico da enzima utilizada, em que ocorre mudança de cor na solução através de catálise enzimática. A intensidade da cor é estimada colorimetricamente e é proporcional a concentração do anticorpo pesquisado.
Principais vantagens do método ELISA direto
- Utiliza anticorpo primário, por isso é mais simples
- Mais rápido porque menos etapas são usados
- A reatividade cruzada do anticorpo secundário é eliminada
ELISA indireto
O ELISA indireto é o mais amplamente empregado e também é utilizado na dosagem de anticorpo.
Esse tipo é semelhante ao direto, mas se utiliza um anticorpo secundário marcado. Por utilizar esse anticorpo secundário, o teste indireto apresenta maior especificidade no teste.
Principais vantagens do método ELISA indireto
- Grande variedade de anticorpos secundários com diferentes marcadores
- Versátil
- A especificidade do anticorpo primário não é afetada
- Maior sensibilidade e possibilidade de amplificação do sinal
- Maior especificidade no teste por usar anticorpo secundário
ELISA sanduíche
Esse ensaio é caracterizado por utilizar antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos tanto na fase sólida quanto sob a forma de conjugado.
Dessa forma, é possível fazer a detecção simultânea de imunoglobulinas de diferentes classes. Para a realização da técnica do ELISA sanduíche, o antígeno específico e conhecido é fixado aos poços contidos em uma placa sólida à qual serão adicionados dois anticorpos contidos na amostra sorológica.
Depois que ocorre os procedimentos intermediários (incubação e lavagem) será adicionado um conjugado (anticorpo ligado à enzima). Esse complexo do anticorpo ligado à enzima reage com os dois primeiros anticorpos adicionados.
Em seguida, após incubação e posterior lavagem para retirada dos anticorpos não ligados, é adicionada uma substância que irá reagir com a enzima, ocorrendo mudança de cor na solução através de catálise enzimática.
Por conta disso, a possibilidade de detectar anticorpos da classe IgM torna esse ensaio mais sensível do que os demais para identificação da fase aguda de doenças.
ELISA por competição
A técnica ELISA por competição consiste em um teste em que a presença de antígenos em determinado soro é revelada pela competição com um antígeno marcado por um anticorpo específico.
Esse método é utilizado principalmente quando o antígeno testado possui poucos epítopos de ligação ou é muito pequeno. No método, a amostra contendo o antígeno teste e anticorpo específico é adicionada à placa contendo antígeno ligado à uma enzima.
Assim, o antígeno ligado irá competir com o antígeno da amostra, pois o anticorpo possui afinidade para ambos. Vale lembrar que quanto maior a concentração de antígenos teste que se ligam, maior se´rá o grau de inibição dos antígenos marcados.
Dessa forma, o grau de competição é proporcional à quantidade de antígenos contidos na amostra. Nesse método, a coloração aparecerá nos orifícios onde não havia ligação entre anticorpos e antígenos teste. Portanto, a positividade do exame se dá pela ausência de mu- dança de coloração.
Quando pedir um Elisa?
O teste Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) é usado para detectar a presença de anticorpos ou antígenos específicos no sangue de uma pessoa. Podem ser pedidos para:
- Diagnóstico de infecções: pode ser usado para detectar a presença de anticorpos específicos em casos de infecções virais, como HIV, hepatite B e hepatite C. Esses testes são frequentemente usados como parte do diagnóstico inicial de infecções.
- Rastreamento de doenças: usado como parte de programas de rastreamento para determinadas doenças. Por exemplo, ele pode ser utilizado para detectar a presença de anticorpos contra a sífilis em gestantes.
- Acompanhamento de tratamento: solicitado durante o tratamento de doenças infecciosas para monitorar a resposta do paciente à terapia. Por exemplo, no caso de infecção pelo HIV, o teste ELISA é frequentemente usado para monitorar a carga viral e a progressão da doença.
- Detecção de alergias: pode ser usado para identificar alergias específicas, como alergia a amendoim, pólen ou mofo. Esses testes medem a presença de anticorpos IgE no sangue, que são produzidos em resposta a substâncias alérgicas.
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Referência bibliográfica
- Abbas AK, Lichtman AH, Pillai SHIV. Imunologia celular e molecular. 8. ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2015.
- Ministério da Saúde (BR). Manual Técnico para o Diagnóstico da Infecção pelo HIV em Adultos e Crianças. Brasília: Ministério da Saúde, 2016.
Sugestão de leitura complementar
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